Adv. Funct. Mater.:供体和 π

内容提要

在本研究中，我们提出了一种 I 型聚集诱导发光（AIE）光敏剂 MDPA-T-TCP，其通过精确设计 4,4,4'- 甲氧基二苯胺供体和噻吩 π 桥而得。这种设计具有扭曲的供体部分、π 桥的平面结构以及与噻二唑 - 氰基吡啶受体的结合，增强了供体 - 受体相互作用，与不含甲氧基供体或苯基 π 桥的光敏剂相比，显著增强了 NIR-II 荧光并促进了羟基自由基的产生。MDPA-T-TCP 还具有可观的光热转换效率，进一步增强了其双重治疗和诊断潜力。MDPA-T-TCP 纳米颗粒能够实现有效的 NIR-II 成像引导协同光动力 - 光热疗法，成功实现肿瘤消融。

分子合成和光物理性质

本研究采用供体与 π 桥的协同调控策略。分子骨架中引入扭曲的二苯胺单元作为供体，以增强聚集态下的分子内旋转自由度。噻二唑和氰基吡啶基团作为强受体，可促进显著的分子内电荷转移（ICT），从而实现长波长的吸收和发射。在化合物 MDPA-P-TCP 和 MDPA-T-TCP 中，甲氧基的引入增加了自由体积，使结构更易扭曲和分子运动，有望高效产热。选择苯基和噻吩单元作为 π 桥，以微调化合物中的 ICT 行为和共轭作用。首先利用紫外 - 可见光谱和光致发光（PL）光谱技术研究了 DPA-P-TCP、MDPA-P-TCP 和 MDPA-T-TCP 的光物理性质，包括吸收光谱和发射光谱。在二甲基亚砜溶液中，三种化合物的吸收光谱逐渐红移，DPA-P-TCP 的吸收峰位于 492 nm，MDPA-P-TCP 的吸收峰位于 517 nm，MDPA-T-TCP 的吸收峰位于 599 nm。与 DPA-P-TCP 和 MDPA-P-TCP 相比，MDPA-T-TCP 的吸收最大值显著红移，这可归因于其较强的分子内电荷转移效应。所有化合物在溶液中均显示出较弱的发射。例如，MDPA-T-TCP 在二甲基亚砜溶液中发射微弱，表明在孤立状态下，分子内运动可能会促进非辐射跃迁，低频率振动产生的高重组能也印证了这一观察结果。随着混合体系中甲苯比例的增加，发射增强，这表明聚集状态通过限制分子内运动抑制了非辐射跃迁。在聚集状态下，三种化合物的荧光发射最大值分别为：DPA-P-TCP 为 751 nm，MDPA-P-TCP 为 826 nm，MDPA-T-TCP 为 825 nm。DPA-P-TCP、MDPA-P-TCP 和 MDPA-T-TCP 在聚集状态下的发射增强现象证实了它们典型的聚集诱导发光特性。在 660 nm 激光（0.3 W・cm⁻²）照射 5 分钟后，MDPA-T-TCP 的活性氧生成量增加了 587 倍，显著高于 DPA-P-TCP（85 倍）和 MDPA-P-TCP（288 倍）。为了进一步确定化合物在光照射下产生的活性氧类型，研究使用了市售的活性氧指示剂，包括 9,10 - 二甲基蒽（ABDA）、二氢罗丹明 123（DHR123）和羟苯基荧光素（HPF），分别检测单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子（O₂⁻⁻）和羟基自由基（・OH）的生成能力。对比分析表明，与 ABDA 对照组相比，经 DPA-P-TCP 处理并在 660 nm 激光（0.3 W・cm⁻²）照射 5 分钟后，ABDA 的吸收强度显著降低，而在 MDPA-P-TCP 或 MDPA-T-TCP 存在下，ABDA 的紫外 - 可见光谱信号损失极小，这表明单线态氧的生成有限。此外，三种化合物经 DHR123 处理并光照 5 分钟后，荧光略有增强，表明超氧阴离子的生成量可忽略不计。令人欣喜的是，在 MDPA-T-TCP 存在下，连续激光照射 5 分钟后，HPF 的荧光强度增加了 230 多倍，显著超过了其他化合物组和单独的 HPF 对照组，这表明 MDPA-T-TCP 能高效生成羟基自由基。

通过将这三种化合物封装在 1,2 - 二硬脂酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺 - N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000）基质中，组装成纳米颗粒（NPs）。这种封装赋予了纳米颗粒优异的水分散性，并提高了其生物应用的生物安全性。DPA-P-TCP、MDPA-P-TCP 和 MDPA-T-TCP 的封装效率经测定分别为 80.42%、70.39% 和 92.60%。通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）对纳米颗粒的尺寸和形貌进行了表征。DLS 分析显示，DPA-P-TCP、MDPA-P-TCP 和 MDPA-T-TCP 纳米颗粒水溶液的平均直径分别为 123、106 和 122 nm。TEM 和 SEM 图像证实了纳米颗粒的球形形貌。此外，DPA-P-TCP 纳米颗粒、MDPA-P-TCP 纳米颗粒和 MDPA-T-TCP 纳米颗粒的 Zeta 电位经测定分别为 - 12.6±1.5、-11.9±1.2 和 - 13.0±0.6 mV。值得注意的是，MDPA-T-TCP 纳米颗粒在 PBS 缓冲盐水中表现出良好的胶体稳定性，在室温下放置 7 天，其尺寸变化极小。随后，测定了这些纳米颗粒在水溶液中的吸收光谱。观察到的峰值吸收值分别为 490、520 和 600 nm。显然，MDPA-T-TCP 纳米颗粒更有利于被长波长光源激发。它们的荧光光谱位于 700-1200 nm，且 MDPA-T-TCP 纳米颗粒的荧光可延伸至 1200 nm，适用于近红外二区成像。用噻吩环取代苯环可能增强了电荷转移跃迁，并诱导了更平面的构象。甲氧基的引入可增强供体的给电子能力，导致吸收和发射红移，这对生物应用是有利的。采用非发射性的二氯荧光素（DCFH）作为探测器来检测整体的活性氧生成行为。二氯荧光素遇到活性氧时会被氧化，形成发出绿色荧光的 2'，7'- 二氯荧光素（DCF），在约 530 nm 处产生强荧光信号。单独的二氯荧光素在激光照射（660 nm，0.3 W・cm⁻²）下荧光可忽略不计。然而，在纳米颗粒存在的情况下，相同条件下观察到荧光明显增强，表明所有纳米颗粒均能生成活性氧。值得注意的是，MDPA-T-TCP 纳米颗粒表现出优异的活性氧生成能力，照射 5 分钟后发射强度显著增加 414 倍，而 MDPA-P-TCP 纳米颗粒增加 342 倍，DPA-P-TCP 纳米颗粒增加 48 倍。DPA-P-TCP 纳米颗粒和 MDPA-P-TCP 纳米颗粒活性氧生成量较低，这归因于它们在 660 nm 处的弱吸收和相对较低的系间窜越效率。为进一步确定照射下纳米颗粒产生的活性氧类型，采用 ABDA、DHR123 和 HPF 作为探针，分别检测单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子（O₂⁻⁻）和羟基自由基（・OH）的生成能力。MDPA-T-TCP 纳米颗粒相比其他化合物更倾向于生成羟基自由基，而非单线态氧或超氧阴离子，且其羟基自由基生成量最高，这与它们在聚集态下的行为一致。

体外和体内成像

经 660 nm 激光（0.3 W・cm⁻²，5 分钟）照射后，4T1 细胞的存活率随 MDPA-T-TCP 纳米颗粒浓度的增加而显著下降。在常氧环境中，当 MDPA-T-TCP 纳米颗粒浓度超过 50 μM 时，4T1 细胞的存活率降至 50%以下，表明 MDPA-T-TCP 纳米颗粒对癌细胞具有有效的光毒性。得益于 MDPA-T-TCP 纳米颗粒优异的 I 型活性氧生成性能（这类活性氧受氧浓度的影响较小），其在缺氧条件下对癌细胞的杀伤效率与常氧条件相近。此外，通过钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein-AM）和碘化丙啶（PI）活死细胞染色（分别作为活细胞和死细胞的荧光探针），评估了 MDPA-T-TCP 纳米颗粒在光诱导下对 4T1 细胞的光动力杀伤活性。仅在 MDPA-T-TCP 纳米颗粒加激光照射组中，无论是常氧还是缺氧条件下，4T1 细胞均被完全染成红色，而其他三组均呈现出强烈的钙黄绿素 - AM 绿色荧光信号。MDPA-T-TCP 纳米颗粒在激光辅助下具有优异的光动力抗肿瘤能力，且其光动力抗肿瘤能力几乎不受氧浓度的影响，表明 MDPA-T-TCP 纳米颗粒有望克服传统光动力疗法中缺氧抑制的固有瓶颈。利用 MDPA-T-TCP 纳米颗粒强大的活性氧生成能力，研究了其在缺氧条件下对 4T1 细胞的杀伤效果，发现在缺氧环境中其仍具有持续的抗肿瘤作用。为阐明在缺氧和常氧环境下细胞内活性氧的生成情况，采用二氯荧光素（DCFH）作为指示剂。细胞被分为四组：PBS 组、PBS + 激光组、MDPA-T-TCP 纳米颗粒组和 MDPA-T-TCP 纳米颗粒 + 激光组。共聚焦激光扫描显微镜结果显示，仅在纳米颗粒处理并经激光（660 nm，0.3 W・cm⁻²）照射 5 分钟的细胞中，观察到氧化活性氧产物发出的显著荧光信号。为评估细胞内 I 型活性氧的产生情况，采用羟苯基荧光素作为羟基自由基的荧光探针。共聚焦激光扫描显微镜图像显示，经照射后，羟苯基荧光素染色的细胞呈现出明亮的绿色荧光，表明 MDPA-T-TCP 纳米颗粒在 660 nm 光激活下主要产生羟基自由基。这些结果表明，MDPA-T-TCP 纳米颗粒能够通过 I 型光化学反应途径产生羟基自由基，从而有望摆脱对氧气的依赖，在体内更好地发挥作用。为评估其体内应用效果，向荷有原位 4T1 乳腺癌的 BALB/c 小鼠静脉注射 MDPA-T-TCP 纳米颗粒。随后评估了 MDPA-T-TCP 纳米颗粒的体内近红外一区和近红外二区荧光成像能力。近红外一区和近红外二区荧光成像均能清晰显示肿瘤位置，且由于背景信号干扰较小，近红外二区成像的亮度更优，肿瘤进行的时间依赖性近红外二区荧光成像显示，注射后 12 小时荧光强度达到峰值，随后逐渐下降，表明 MDPA-T-TCP 纳米颗粒在肿瘤部位有显著且持续的聚集。这些发现凸显了近红外二区荧光成像在肿瘤精确定位和长期监测中的潜力。热成像结果进一步显示，注射后肿瘤部位温度迅速升高，从 27.1℃升至 43.8℃，而生理盐水处理的小鼠仅出现轻微的温度上升。

MDPA-T-TCP 纳米颗粒的体内治疗

为阐明 MDPA-T-TCP 纳米颗粒的 I 型光动力/光热协同抗肿瘤效应，研究开展了体内光疗实验。将荷瘤小鼠随机分为四组（PBS 组、PBS + 激光组、MDPA-T-TCP 纳米颗粒组、MDPA-T-TCP 纳米颗粒 + 激光组），并在 14 天内监测肿瘤体积和小鼠体重。接受激光照射或仅接受纳米颗粒处理的组中，肿瘤体积显著增大。与之形成鲜明对比的是，接受纳米颗粒联合激光治疗的小鼠肿瘤明显缩小，凸显出 MDPA-T-TCP 纳米颗粒的光疗效果，可实现肿瘤的显著消融。MDPA-T-TCP 纳米颗粒 + 激光组小鼠的体重与对照组相比保持稳定，表明 MDPA-T-TCP 纳米颗粒具有较高的生物安全性，无不良影响。为进一步探究其抗癌机制，研究进行了组织学和免疫组织化学分析。肿瘤切片的苏木精 - 伊红（H&E）染色显示，光动力疗法与光热疗法的联合作用对肿瘤组织造成了严重损伤，导致明显的细胞异常。与含有大量完整肿瘤细胞的对照组相比，MDPA-T-TCP 纳米颗粒 + 激光组的肿瘤细胞出现显著的核凋亡和高密度空泡。研究还通过 Ki67 染色（一种知名的增殖标志物）检测肿瘤细胞的增殖能力，结果显示，与其他组相比，接受 MDPA-T-TCP 纳米颗粒联合激光治疗的肿瘤增殖能力显著降低，凋亡增加。末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）免疫荧光染色进一步证实，MDPA-T-TCP 纳米颗粒 + 激光治疗组的肿瘤细胞发生了广泛凋亡。

总结

在本研究中，我们展示了一种 π 桥与供体工程策略，旨在设计出一种结构简单却功能多样的聚集诱导发光（AIE）光疗诊断剂 MDPA-T-TCP。该试剂有效整合了近红外二区（NIR-II）荧光成像、增强的羟基自由基（・OH）产生能力以及显著的热输出功能，可用于精准肿瘤治疗。通过引入噻吩 π 桥和具有柔性的甲氧基修饰供体，MDPA-T-TCP 实现了吸收和发射波长的延伸，并具备高光热转换效率。实验与理论分析均强调了分子设计在提升光敏剂性能方面的重要性，尤其是噻吩 π 桥与噻二唑 - 氰基吡啶受体的平面结构。体外和体内研究进一步证实，MDPA-T-TCP 纳米颗粒借助 NIR-II 成像引导的光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），具有强大的肿瘤消融潜力。

参考文献